关于到底什么是基因毒性杂质？为什么要单独严控它？限度怎么算、控制策略怎么定，日常工作该怎么管控？这些问题，大家应该零零散散听过一些相关培训，可是每每提及这个板块，你是不是仍然心里有点发虚，似懂非懂…
恭喜道友，遇见了我们，跟着我们一起学习吧，彻底把基因毒杂质核心要点一次性学透，让你学完就能上阵杀敌。
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什么是基因毒性杂质？
基因毒性杂质是指在较低水平下即可直接引起DNA损伤，导致DNA突变，存在致癌风险的DNA反应性物质。
与普通杂质相比，基因毒杂质即使极低剂量也可能对遗传物质造成损伤，存在致癌、致突变隐患。
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普通杂质：超标可能引发不良反应或纯度不达标
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基因毒性杂质：极低剂量即可造成遗传损伤，风险更高
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基因毒性杂质有哪些类别呢？
根据ICH M7，法规将不同杂质按照以下定义分为5种。
ICH M7 1类杂质是我们已知的致突变且致癌作用，也就是说网上可以查到临床毒性数据；
ICH M7 2类杂质对我们而言，是已知的致突变作用，即做过细菌致突变实验证实了具备致突变性，但致癌性还未被证实，很难查到毒理学数据；
ICH M7 3类杂质具备警示结构单元，但与原料药结构无关，即是本身就具备的警示片段，需要重视。
ICH M7 4类杂质具备警示结构单元，但与原料药或原料药相关物质（如中间体）具有相同的警示结构，经测试无致突变性，可以按一般有机杂质控制。
ICH M7 5类杂质不具备警示结构单元，或已经被证明无致突变性或者致癌性，按一般有机杂质控制。
那么哪些结构被称为警示结构呢？
下图展示了具有遗传毒性化合物警示结构单元的物质，表明若某杂质结构具备下面结构单元，即含有警示结构，可能为基因毒杂质，当然，也可能不是，比如某些"解毒基团"的存在可以影响化合物的电荷分布，或者形成空间位阻，从而影响基因毒性，达到"解毒"效果。
究竟是否为基因毒性杂质可参考QSAR预测结果分析。
综上，可以看到，从1类到5类，作为"基因毒性杂质的特殊身份"等级逐渐下降，像4类、5类，可以作为普通杂质进行控制。
除了以上分类，还有一些公认的基因毒性杂质：（1）亚硝胺类杂质
FDA《人用药物中亚硝胺杂质的控制》已明确7个潜在亚硝胺杂质：NDMA、NDEA、NMBA、NIPEA、NDIPA、NDBA、NMPA
（2）残留溶剂（1类）
ICH Q3C 里的 I 类（Class 1）残留溶剂有以下5种：
其中，苯，1,2 - 二氯乙烷、1,1 - 二氯乙烯属于基因毒性杂质；在法规归属上，它们既是 Q3C 管控的残留溶剂，也属于 ICH M7 定义的基因毒性杂质范畴。
根据毒理和 ICH M7 定义：
苯：明确基因毒性致癌物（诱变 + 致癌），M7 附录有 AI 限值。
1,2 - 二氯乙烷、1,1 - 二氯乙烯：强疑似 / 阳性基因毒性，属于 M7 管控的诱变致癌 。
四氯化碳：动物致癌，但常规试验多为非基因毒性（主要是肝毒性、非遗传毒性机制）；Q3C 归为 I 类（致癌物），一般不按 M7 基因毒性杂质管理，而是按 Q3C 的 PDE 控制。
1,1,1 - 三氯乙烷：因环境危害列入 I 类，无证据表明有基因毒性或人体致癌性。
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为什么基因毒性杂质要单独设严格限度？
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根据基因毒性杂质的定义可知，与普通杂质相比，基因毒性杂质即使极低剂量也可能对遗传物质造成损伤，存在致癌、致突变隐患，因此，药品安全有效是我们生产企业的底线，基因毒性杂质不能直接套用常规杂质标准，需要制定更严格的限度。
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基于此，各国药监部门的监管要求也是十分严苛：国内外药典、ICH指导原则、国内法规均制定专项管控要求，限度标准远严于普通杂质；并且在研发、生产、申报各阶段的全生命周期进行管控：均需严格核查，超标将影响申报进度和上市
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基因毒性杂质限度，到底怎么计算？？
了解了基因毒性杂质的背景知识，知道是什么，为什么要设严格的限度以后，重头戏来了！这也是让很多小伙伴学习到此章节最头疼的问题：基因毒性杂质的限度如何计算？
计算公式如下：
该公式可以有3种转换形式，限度可以用PDE（每日允许暴露量），AI（终身可接受的摄入量）或者TTC（毒理学关注阈值）除以剂量得到。
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先看PDE（每日允许暴露量）
如何计算
F1：代表从不同物种外推到人的因子；
F2：为个体差异因子；
F3：为根据毒性暴露周期采用的可变因子；
F4：根据毒性严重情况采用的可变因子；
F5：在公式采用NOEL时一般为1，采用LOEL时根据毒性的严重程度，F5可以使用高达10的因子。
公式中的NOEL可以换成以下任何一种毒理学数据，从风险控制来说，我们通常首选NOEL计算，如无NOEL可用LOEL，从下图可知，从NOEL到LD50数值逐级变大，所计算限度也逐渐增大，意味着对基因毒性杂质的控制要求也在逐渐下降。
很多时候无法查询到NOEL与LOEL，只能查到LD50（半数致死量）与TD50（半数致畸量）。那限度如何计算呢？
PDE=TD50/50000×50=TD50/1000
（源自ICHM7)
NOEL=LD50/2000
(源自欧盟原料药委员会发布的《原料药工厂中清洁验证指南》，2000为经验常数）
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再看AI（终身可接受的摄入量）
如何计算
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终身可接受的摄入量 AI = TD50/50000 × 50 kg
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短期用药：按时间比例放大
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再看TTC（毒理学关注阈值）
如何计算
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行业通用参考标准：TTC：1.5 μg / 天（终身暴露，70 年）
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短期暴露：可按时间比例放宽
简单讲：不管是哪种基因毒性杂质，成年人每天摄入不超过 1.5 微克，就被认定为可接受的安全水平，以此折算成药品中的限量标准。
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如何基于 ICH M7 的基因毒性杂质分类选择合适的计算方式呢？
思路梳理
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一般拿到理论杂质谱，先进行QSAR 软件预测，根据预测得到的ICH M7的分类（也可通过数据库查询）将杂质分为是否为已知的致突变 / 致癌物；
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若数据库已知，如已知致突变致癌物、已知致突变物、已知非致突变物分别归入 Class 1（用 TD50、PDE 控制）、Class 2（用 TTC 控制）、Class 5（按 ICH Q3A/B 一般杂质控制）；
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若数据库无相关信息，则通过 QSAR 软件评估或 Ames 试验（见下文）进一步判断：结果为阴性时归入 Class 4 或 Class 5，按一般杂质控制；结果为阳性时归入 Class 2 或 Class 3，采用 TTC 控制；结果不确定时，可选择先做 Ames 试验，阳性则归入 Class 2/Class 3 按 TTC 控制，阴性则归入 Class 4/Class 5 按一般杂质控制，仍不确定则需进行类似物对比，最终为不同风险等级的杂质匹配对应的控制策略。
补充：Ames 试验（艾姆斯试验，Ames test）：
1.定义：全称鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是ICH M7 基因毒性杂质管控里最核心、最基础的体外致突变筛选试验。
2.意义：由 Bruce Ames 建立，用来快速检测一个化合物有没有诱发基因突变的能力。
3.原理：选用营养缺陷型沙门氏菌 / 大肠杆菌：天然菌株自身无法合成组氨酸，无外源诱变物质时，几乎不能生长； 加入待测化合物 + 代谢活化系统（模拟人体肝脏代谢）； 若化合物有致突变性：会诱发细菌基因回复突变，重新获得合成组氨酸能力，在缺组氨酸平板上长出菌落； 菌落数量显著多于空白对照 → 判断为致突变阳性；反之阴性。
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基因毒性杂质的控制策略有哪些？
这就是重点！
实战演练
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方法一：直接在成品中控制
1.加入质量标准，限度0.15ppm；或
2.三批生产批或六批中试批检测值1%（0.0015ppm）或30%以下（0.045ppm），定期检测
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方法二：在前面步骤进行控制
1.加入质量标准，限度不变，仍为0.15ppm
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方法三：在前面步骤进行控制
1.加入前面步骤的质量标准，制定更松的合理限度
2.同时，在成品中的检测值徐低于限度的1%（0.0015ppm）或者限度的30%以下（0.045ppm）
这里要综合考虑到分析方法的灵敏度，定的越严，对方法的灵敏度要求越高。
