等度洗脱色谱分离如1km赛跑，不同选手（化合物）在起跑线（色谱柱柱头）准备比赛，于同一时间点出发，不同选手具有不同的运动能力（保留因子），在不同时间点到达终点（色谱柱柱尾）区分成绩（分离度）。比赛成绩可以是4分钟，也可以是8分钟，甚至有的选手运动能力太差，其他选手跑了很远的距离，而该选手仍在原地（停留在色谱柱柱头），需要1个小时才能跑完。
色谱分离追求分离和保留时间的平衡：在实现分离的同时也要尽量减小保留时间，除节省时间（成本）外，另一个重要的因素是保留因子太大，峰展宽严重，灵敏度降低。在"色谱"比赛中，不允许存在4分钟和1小时的差距，需要帮助运动能力差的选手也尽量在10分钟内完成比赛，具体做法是给每一个选手设定特定的跑道，跑道可以随着时间慢慢向下倾斜（增加有机相比例），运动能力差的选手在一开始还停留在原点，随着其他运动能力强的选手到达中点甚至终点时，因跑道已经足够倾斜，跑动阻力降低，可以相对较为轻松地到达终点，原来需要1小时，现在也只需要10分钟。
梯度洗脱相对于等度洗脱，有自身的一些特点。梯度洗脱能够实现保留能力相差较大的化合物能够在同一个色谱条件下进行检测；梯度洗脱有一个额外的优势，各色谱峰峰宽相当，而等度洗脱时保留越强峰宽越大（灵敏度下降）。
本文主要讨论梯度方法开发的相关知识：梯度洗脱、梯度洗脱保留因子、梯度方法建立及优化、滞留体积的影响。
1.梯度洗脱
梯度洗脱指的是流动相在分离过程中持续改变，有机相比例逐渐提高，后洗脱出来的色谱峰保留因子不断减小。有机相比例可以是线性的变化，也可以是非线性的变化。线性变化梯度能给出更好的分离效果，分析研发中大多使用的是线性梯度，软件模拟分析方法也是基于线性梯度模型。
图1 线性梯度洗脱
备注：本文大多数黑白插图均来自于《现代液相色谱技术导论》。
等度洗脱过程中，化合物保留因子保持不变；在梯度洗脱过程中，有机相比例不断升高，化合物保留因子不断减小。
图2 梯度洗脱过程中的色谱峰迁移
实线x表示化合物i在色谱柱中的位置（x=0，在柱头；x=0.5，在色谱柱中点；x=1，在柱尾）。化合物i的瞬时保留因子（虚线k）随着梯度的进行越来越小，在色谱柱中点时对应的保留因子k*决定了色谱峰的峰宽，在柱尾的保留因子ke为k*的一半（统计计算得出）。
化合物j除了启动时间比化合物i晚之外（i洗脱时，j因保留因子巨大，停留在柱头），随着有机相比例的升高，保留因子急剧下降，在色谱柱中的色谱行为与化合物i一致。
化合物i和化合物j除停留在柱头上的时间有差异外，在实际的色谱柱中迁移的时间，二者大致相同。二者经历的展宽过程大致相同，所以峰宽大致相等。
在梯度洗脱中，色谱峰的峰宽由其在色谱柱中点时的保留因子k∗决定，这个k∗与"等效等度条件下"的保留因子对应的峰宽是相当的；因此，即使梯度洗脱中溶质的保留因子k随流动相组成不断变化，也可以用k∗来代表其"平均保留行为"，进而预测峰宽和分离度。
2. 梯度洗脱保留因子k∗
这个公式是基于反相色谱线性溶剂强度（LSS）模型，通过对梯度洗脱过程中溶质移动的质量平衡方程进行积分处理，最终推导出的梯度平均保留因子k∗的简化计算式。
其中tG为梯度变化时间（min），F为流速(ml/min),Vm为色谱柱死体积，ΔΦ为有机相变化值，S为溶质强度系数，对于小分子化合物（500Da以内），S一般为3~5，大分子如多肽一般较大（所以多肽类对梯度变化很敏感）。
以4.6mm×150mm色谱柱（Vm为1.6ml），流速为1ml/min，在10分钟内梯度由5%~95%（ΔΦ为0.90），S取4，计算得到k∗等于1.5。
（1）梯度变化时间tG
tG为梯度变化时间（min），由公式可知，tG越大，k*越大，这点不难理解，梯度变化缓慢，保留时间越长，保留因子越大。
（2）流速F
F为流速(ml/min),由公式可知，F越大，k*越大，这点与常识相违背，流速越大，保留时间越短，保留因子应更小。实际上，流速越大，保留时间越短，化合物离开色谱柱时流动相中有机相比例越低，对应的保留因子越大(k=(1-R)/R)。
（3）色谱柱死体积V m
色谱柱死体积Vm越大，保留因子越小，如增加色谱柱长度，Vm增大，保留因子减小。
保留因子的计算公式为Vm=5×10-4Ldc2。其中L为色谱柱长度，dc为色谱柱内径。也可用硫脲（无保留）的保留时间与流速相乘得到。
（4）有机相变化值ΔΦ
有机相变化值ΔΦ越大，洗脱能力越强，保留越弱，保留因子越小。
（5）方法转换
有时，在既定方法的基础上，在不损失分离度的情况下不得不对色谱条件做一些改变，比如普通的色谱条件需要转换到LC-MS/MS上，ESI离子源通常要求较小的流速，且色谱柱规格也需改变；或者用超高效液相色谱批量开发分析方法（通常为粒径小的短柱），转到高效液相色谱上，色谱柱规格通常也需要相应改变（粒径和柱长等）。
从上述公式可知，要维持一致的保留因子，改变一个条件，其他条件也要相应的改变。
假设需要将高效液相色谱方法转到LC-MS/MS上，色谱柱由
4.6mm×150mm，5μm变更为2.1mm×100mm，3μm，以下是赛默飞官方网站转化的结果。
表1 分析方法梯度转换示例
根据变更后色谱柱粒径大小，设计流速为0.347ml/min，同时计算出色谱柱死体积再根据保留因子计算公式，可以算出梯度变化时间为8分钟。也可以根据需要设置不同的流速，但是对应的梯度变化时间也需要相应的改变以维持相同的保留因子k*。
另外，进样体积不参与保留因子计算，但小规格色谱柱载样量较小，且一般柱效更高，可按色谱柱死体积比例对应的降低进样体积。
图3 梯度转换前后色谱图
备注：本文大多数彩色插图均为豆包生成。
3. 梯度方法建立及优化
方法开发时，尽量选择小粒径色谱柱（柱效高，死体积小，可减小梯度时间，注意仪器耐受压力），选择合适的梯度（如5%~95%）及梯度时间（如20分钟），使保留因子k*约为5。
根据初步的试验结果，判定可能需要进行哪些调整。
（1）不需要调整
图4 模拟色谱图1
在模拟色谱图1中，各化合物在20分钟均匀分散，分离度良好。无需进行调整。
（2）调整最终的B%
图5 模拟色谱图2
在模拟色谱图2中，各化合物均匀分散，分离度良好，但是最后一个色谱峰保留时间为12分钟，可以减小运行时间，将梯度由20分钟，5%~95%改为15分钟，5%~67.5%，可节省五分钟的时间。
（3）调整初始的B%
图6 模拟色谱图3
在模拟色谱图3中，各化合物均匀分散，分离度良好，但是第一个色谱峰保留时间为8分钟，可以减小运行时间，将梯度由20分钟，5%~95%改为15分钟，27.5%~95%，可节省五分钟的时间。
出峰较早的化合物易受初始有机相比例的影响，初始有机相比例越低，影响就越小，故与调整最终的B%不一样的是（通常不影响分离度），调整初始的B%需要关注出峰较早的色谱峰之间分分离度，有可能存在分离度的问题，此时可能需要设计一段等度洗脱使出峰较早的化合物实现分离。
（4）需要增大保留因子
图7 模拟色谱图4
在模拟色谱图4中，化合物6和7无法分离，通常提高保留因子有助于色谱峰分离，可将梯度时间增大尝试。如果6或者7对于其他化合物来说，属于非规则样品（规则样品的S值和logK具有很强的关联性），调整梯度时间可能出现与预计相反的趋势（如出峰位置反转），可以在此基础上进一步考察；如果增大梯度时间，两峰之间完全无分离趋势，说明调整梯度很难分离。此时需要调整选择性进行分离，改变柱温是一个较为简便的操作。如果没有效果，需要改变其他条件（如流动相pH值等）。
（5）梯度转换为等度
图8 模拟色谱图5
在模拟色谱图5中，各化合物均匀分散，分离度良好，各峰集中在5分钟内出峰，与梯度变化时间相比，时间较短，此时可以改为等度洗脱。
最后一个化合物与第一个化合物的保留时间之差ΔtR与梯度时间tG之比，如果ΔtR/tG≤0.25，使用等度洗脱；如果ΔtR/tG≥0.40，使用梯度洗脱；ΔtR/tG为中间值，使用等度或者梯度洗脱均可。
在模拟色谱图5中，ΔtR/tG=0.25，可使用等度洗脱。
梯度洗脱可按照下列公式转化为等度洗脱。
式中，Φiso为根据梯度条件和试验结果计算得出的等度有机相比例；ΔΦ为有机相变化值（0.9）；tG为梯度变化时间（20min）；[tR]avg为第一个化合物与最后一个化合物保留时间平均值（（8+13）/2=10.5min），t0为色谱柱死时间（1.6min），tD为滞留时间（1min）；Φ0为初始有机相比例（0）；k∗为平均保留因子（3.0）；S为溶质强度系数（4）。
这个公式计算的目的是使等度保留因子在1~10或0.5~20范围内，对应梯度洗脱中第一个峰和最后一个峰的几何均值为根号10，即3.2，该值为化合物流出色谱柱的保留因子（即ke），所以对应的k*为6.4。
上述计算的Φiso为0.35，即使用35%的有机相比较合适。
4.滞留体积的影响
采用梯度洗脱，梯度变化不能及时反应到色谱柱上，流动相需要穿过梯度混合器到色谱柱入口这段体积，这个体积即滞留体积（VD），对应需要消耗的时间为滞留时间TD（滞留体积与流速之比，VD/F）。
图9 滞留体积对梯度的影响
液相一般配制二元泵或者四元泵，二者混合方式不同，二元泵为高压混合，四元泵为低压混合，二者的滞留体积计算方式有所不同。
图10 高压混合与低压混合滞留体积对比
滞留体积相当于多了一段有机相比例较小的等度洗脱，滞留体积对出峰较早的色谱峰影响较大。不同仪器延迟体积的差异对分析方法转移来说是一个高风险点，在方法开发初期，需要考虑滞留体积的影响，尽量避免使用从0min开始即变换梯度，可以增加一段等度洗脱（方便后续调整，中国药典2025）。
图11 滞留体积计算（0~100%梯度）
滞留体积可以通过如下方式进行计算。
（1）延长梯度直线与横坐标相交，交汇点的时间即为滞留时间，乘以流速即为滞留体积。
（2）以50%响应点对应时间点记为t1/2，滞留时间tD=t1/2-0.5 tG，乘以流速即为滞留体积。
5.总结
梯度洗脱如另类的赛跑，运动能力差的选手出发慢，但是跑跑动阻力越来越小（有机相比例增加），跑的更轻松，也就更快，与其他选手到达终点的时间不至于相差太多。但是跑动阻力不能减地太快，不然所有选手都快速到达 终点，不能区分成绩。对应的梯度开发设计，需要根据色谱柱类型，设计合适的梯度，使平均保留因子在5左右，在此基础上进行调整和优化，必要时需要改变选择性（经常需要）。在开发时，需要关注延迟体积对分析方法的影响，建议在初始阶段设置一段等度洗脱